Identificación de una triparedoxina peroxidasa citoplasmática en Leishmania braziliensis / Identification of a cytoplasmic tryparedoxin peroxidase from Leishmania braziliensis / Identificação de uma triparedoxina peroxidase citoplasmica de Leishmania braziliensis

Resumen Los sistemas de defensa anti-oxidante utilizados por el parásito intracelular Leishmania braziliensis durante el proceso de infección permiten eliminar especies reactivas de oxígeno y nitrógeno a expensas de equivalentes reductores derivados de la tripanotiona, evitando daños celulares del patógeno. Con el objetivo de identificar potenciales blancos moleculares para el desarrollo de fármacos contra este parásito, se realizó la detección de la enzima triparedoxina peroxidasa citoplasmática de L. braziliensis (LbTXNPxII), la cual es esencial para disminuir concentraciones tóxicas de peróxido de hidrógeno en el contexto de infección. Para esto se generaron anticuerpos policlonales en modelo aviar, partiendo de la clonación, expresión y purificación de la proteína recombinante 6xHis-SUMO-LbTXNPxII (37kDa) en el sistema heterólogo Escherichia coli. La proteína purificada se utilizó como antígeno para la producción de anticuerpos IgY, cuya implementación en estudios in situ permitió detectar y localizar la enzima LbTXNPxII endógena (22kDa) en el citoplasma de promastigotes fijados y verificar su interacción molecular con la nicotinamida/ nicotinato mononucleótido adenilil transferasa, enzima involucrada en la síntesis del NAD. De este modo, se reporta el desarrollo de una herramienta bioquímica para la identificación y estudio de la enzima LbTXNPxII y su participación en vías del metabolismo energético y de defensa anti-oxidante.

Abstract The antioxidant defense systems used by the intracellular parasite Leishmania braziliensis during the infection process make it possible to eliminate reactive oxygen and nitrogen species at the expense of reducing equivalents derived from trypanothione, avoiding cellular damage of the pathogen. In order to identify potential molecular targets for the development of drugs against this parasite, the cytoplasmic tryparedoxin peroxidase of L. braziliensis (LbTXNPxII), which is essential to reduce toxic concentrations of hydrogen peroxide in the context of infection, was carried out. In this regard, polyclonal antibodies were generated in an avian model, starting from the cloning, expression, and purification of the recombinant protein 6xHis-SUMO-LbTXNPxII (37kDa) in the heterologous system of Escherichia coli. The purified protein was used as an antigen for the production of IgY antibodies, whose implementation in in situ experiments allowed the detection and localization of the endogenous LbTXNPxII enzyme (22kDa) in the cytoplasm of fixed promastigotes, as well as the verification of its molecular interaction with nicotinamide/nicotinate mononucleotide adenylyltransferase, an enzyme involved in the synthesis of NAD. Thus, the development of a biochemical tool for the identification and study of the LbTXNPxII enzyme and its participation in energy metabolism and antioxidant defense pathways is reported.

Resumo Os sistemas de defesa antioxidante utilizados pelo parasita intracelular Leishmania braziliensis durante o processo de infecção, permitem a eliminação de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio em detrimento de equivalentes redutores derivados de tripanotiona, evitando o dano celular do patógeno. Com o objetivo de identificar potenciais alvos moleculares para o desenvolvimento de drogas contra esse parasita, foi detectada a enzima citoplasmática triparedoxina peroxidase de L. braziliensis (LbTXNPxII), essencial para reduzir as concentrações tóxicas de peróxido de hidrogênio no contexto de infecção. Para isso, anticorpos policlonais foram gerados em modelo aviário, a partir da clonagem, expressão e purificação da proteína recombinante 6xHis-SUMO-LbTXNPxII (37kDa) no sistema heterólogo de Escherichia coli. A proteína purificada foi utilizada como antígeno para a produção de anticorpos IgY, cuja implementação em experimentos in situ permitiu a detecção e localização da enzima LbTXNPxII endógena (22kDa) no citoplasma de promastigotas fixos e verificar sua interação molecular com nicotinamida/nicotinato mononucleotídeo adenililtransferase, enzima envolvida na síntese de NAD. Assim, é relatado o desenvolvimento de uma ferramenta bioquímica para a identificação e estudo da enzima LbTXNPxII e sua participação no metabolismo energético e nas vias de defesa antioxidante.

Generación de anticuerpos policlonales para la detección de la variante genotípica GIII de PVY, en cultivos de tomate de Árbol y papa de Colombia / Generation of policlonal antibodies for detection of the PVY genotypic variant GIII in tamarillo and potato crops from Colombia

El potyvirus PVY es uno de los agentes causales más frecuentemente asociados a problemas virales en cultivos de papa y tomate de árbol en Colombia. Dada la importancia económica de las enfermedades causadas por PVY y a la necesidad de generar material de siembra certificado por su sanidad viral, es fundamental la generación de herramientas de diagnóstico que permitan la detección temprana de este virus. En este trabajo se reporta la obtención de anticuerpos policlonales específicos, útiles para la detección del genotipo III de PVY (GIII), una de las tres variantes que recientemente han sido reportadas en cultivos de papa y tomate de árbol de la región Andina de Colombia. Como antígeno, se utilizó un péptido sintético diseñado a partir de la región variable del extremo N-terminal del gen de la cápside viral. La sensibilidad de los anticuerpos fue evaluada mediante pruebas de ELISA y dot-blot utilizando péptidos sintéticos. Se realizó una prueba piloto para validar el uso de los anticuerpos a partir de plantas sintomáticas y asintomáticas obtenidas de una región donde confluyen cultivos de ambas solanéceas, encontrándose que los anticuerpos generados ofrecen mayores niveles de detección que los anticuerpos comerciales comúnmente utilizados para detectar los serotipos PVY-O,C y PVY-N de este virus.

PVY is one of the potyvirus more frequently associated with viral infections in tomato and tamarillo crops in Colombia. Due to the economic impact of PVY and the need to certify seeds as virus-free it is important to develop diagnostic tools that allow its premature detection. In this work, the obtention of antibodies detecting the genotype III of PVY is reported. This genotype is one of the three PVY variants infecting tamarillo and potato in the Andean region of Colombia. The N-terminal variable region of the coat protein was chosen as antigen for antibody production. The sensibility of these antibodies was tested by ELISA and dot-blot using synthetic peptides. A pilot test was performed on symptomatic and non-symptomatic plants from a mixed orchard of tamarillo and potato. The generated antibodies showed higher detection levels than the commercial antibodies commonly used to detect the PVY-O,C and PVY-N serotypes.

Desensibilización y trasplante renal: plasmaféresis-IVIG a dosis estándar en pacientes con alto riesgo inmunológico / Desensitization and renal transplant: plasmapheresis/IVIG standard dose in patients with high immunological risk

Introducción: Los pacientes con alto riesgo inmunológico siguen siendo relegados a la cada vez más larga lista de espera de un donador inmunológicamente compatible. El objetivo de esta comunicación es informar la experiencia de un centro de trasplantes en la desensibilización de pacientes con alto riesgo inmunológico. Material y métodos: Estudio descriptivo y retrospectivo de todos los pacientes sometidos a trasplante renal de noviembre de 1999 a enero de 2008, en quienes se llevó a cabo desensibilización pretrasplante renal. Resultados: Ocho pacientes presentaron aloinmunización (pruebas cruzadas positivas o panel reactivo de anticuerpos alto, PRA > 30 %). La desensibilización se realizó mediante sesiones de plasmaféresis con recambio de 1.5 volúmenes plasmáticos, y posterior a cada una se administró una dosis estándar de inmunoglubulina intravenosa (IVIG 5 g/dosis). La inmunosupresión se inició en la primera sesión de plasmaféresis con base en un inhibidor de calcineurinas (tacrolimus); en seis pacientes se añadió mofetil micofenolato y en dos, sirolimus. En siete se obtuvieron pruebas cruzadas negativas con el donador previo al trasplante; en el octavo no se efectuaron. En dos se administró anticuerpos humanizados contra CD25 (20 mg/dosis de basiliximab). Todos los pacientes han mantenido función estable del injerto. Conclusiones: De acuerdo con nuestra experiencia, la sobrevida del injerto renal en pacientes con alto riesgo inmunológico posterior a un adecuado protocolo de desensibilización y estrecha vigilancia postrasplante es similar a la observada en pacientes no sensibilizados, al menos durante el primer año del trasplante.

BACKGROUND: Patients with high immunological risk have been relegated to the growing waiting list for an immunologically compatible donor. Our objective was to report the experience of a transplant center in desensitization of patients with high immunological risk. METHODS: We carried out a descriptive and retrospective study. Included were all the renal transplant patients from November 1999 to January 2008 in which we used plasmapheresis and standard dose of intravenous immunoglobulin (IVIG) as desensitization. RESULTS: Eight patients had history of alloimmunity (positive crossmatch or high panel-reactive antibodies (PRA >30%). Desensitization was accomplished with plasmapheresis and exchange of 1.5 plasma volume. Subsequent to each session we administered a standard dose of IVIG (5 g/dose). Immunosuppression began equal to the first plasmapheresis with calcineurin inhibitor (tacrolimus) plus six patients with mycophenolate mofetil and two patients with sirolimus. In seven cases, negative crossmatches were obtained before the transplantation, except in the eighth case in whom it was not done. Two patients received human antibodies against CD25 (basiliximab, 20 mg/dose). During their evolution, all patients maintained stable graft function. CONCLUSIONS: According to our experience, renal graft outcome in patients with high immunological risk after an adequate desensitization protocol is similar to that observed in nonsensitized patients, at least during the first year of transplantation.

Superioridad del uso de anticuerpos policlonales (Thymogam) en pacientes con trasplantes renales en el Instituto de Nefrología, 2003-2007 / Use superiority of polyclonal antibodies (Thymogan) in patients underwent to renal transplants in Nephrology Institute, 2003-2007

Introducción: Estudio observacional descriptivo de cohorte retrospectiva, para comparar la incidencia de rechazo agudo (RA), su clasificación (Banft 1997) y las causas de pérdidas de los injertos, entre 3 protocolos de inmunosupresión. Métodos: Se estudiaron todos los trasplantes renales, donante cadáver (116), realizados en el Instituto de Nefrología "Dr. Abelardo Buch López", entre los años 2003 y 2007. Se excluyeron los pacientes que perdieron la función renal o fallecieron por causas ajenas al protocolo inmunosupresor empleado. Los protocolos comparados fueron: I. Cuádruple secuencial con anticuerpos policlonales (AcP, Thymogam), II. Cuádruple secuencial con anticuerpos monoclonales (AcM, IOR-T3) y III. Triple. Se analizaron variables inmunológicas como compatibilidad HLA y porcentaje de anticuerpos anti HLA y no inmunológicas, como número de TR, edad del donante, causa de muerte, isquemia fría, necrosis tubular aguda pos TR, días de tratamiento con las terapias biológicas y reacciones colaterales. Se utilizó la distribución de frecuencias y el test de homogeneidad, en el análisis de las variables cualitativas. En las cuantitativas se calculó media aritmética y desviación estándar y se empleó el test de Kruskal Wallis. Resultados: El protocolo I evidenció menor incidencia de la primera crisis de RA (18,5 vs. 33,3 y 43,2 % para los protocolos II y III), sin pérdidas de injertos por RA en el primer año, pese haber sido utilizado en pacientes con mayor riesgo inmunológico, a diferencia de los protocolos II y III donde sí se encontraron pérdidas de los trasplantes en el 22,2 y 20,5 %, respectivamente. Cuando se presentó el RA, la severidad fue mucho menor en el protocolo I (25,0 % sospechoso de RA y 75,0 % RA IA) a diferencia de los RA en los protocolos II y III donde también existió RA IIA y IIB. Conclusiones: El protocolo cuádruple secuencial con AcP, Thymogam, tiene mejores resultados en nuestro medio y es ideal en pacientes de mayor riesgo inmunológico.

Introduction: It is a descriptive and observational and retrospective study to compare acute rejection incidence (AR), its classification (Banft 1997), and causes of grafts lost among three immunosuppression protocols. Methods: Cadaver donor renal transplants (116) were studied in "Dr. Abelardo Buch López" Nephrology Institute from 2003 to 2007. Were excluded those patients with loss of renal function or deceased from causes other than immunosuppression protocol used. Protocols compared were: I. Quadruple sequential with polyclonal antibodies (AcP, Thymogam). II. Quadruple sequential with monoclonal antibodies (AcM, IOR-T3), and III. Triple. Immunological variables analyzed were: HLA compatibility and percentage of anti-HLA antibodies and no-immunologic ones, as TR number, donor' age, death cause, cold ischemia, post-TR acute tubular necrosis, treatment extent (days) using biological therapies and collateral reactions. We used the frequency distribution and homogeneity test in qualitative variables analysis. In the quantitative ones SD and arithmetic mean were estimated and Kruskal Wallis test was used. Results: I protocol evidenced a lower incidence of the first RA crisis during the 1st year in spite of its use in patients with a great immunologic risk, unlike II and III protocols, where there were transplant losses in 22,2 % and 20,5%, respectively. When RA was present, severity was very lower in I protocol (25,0% suspected of RA and 75,0% RA IA) unlike the RAs in II and III protocols where also were RA IIA and IIb. Conclusions: Sequential quadruple protocol with AcP, Thymogan, has better results in our practice and it is ideal in patients with a mayor immunologic risk.

Producción de anticuerpos policlonales IgG contra una proteína con actividad de óxido nítrico sintetasa de Toxoplasma gondii recombinante (NOS-Tg-r) y marcación inmunológica en taquizoítoso / Production of Polyclonal Antibodies against Toxoplasma gondii Recombinant protein with Nitric Oxide Synthase activity and immunologic marking in Tachyzoites

La enzima óxido nítrico sintetasa ha sido estudiada en mamíferos; en los últimos años se ha descrito que existe también en protozoos, pero se desconocen aspectos importantes de su función. Se logró producir anticuerpos policlonales contra la proteína recombinante con actividad de óxido nítrico sintetasa (NOS-Tg-r) de Toxoplasma gondii y realizar marcación inmunológica en taquizoítos. Se usaron dos conejos Nueva Zelanda (Oryctolagus cuniculus)que se inmunizaron por vía intramuscular con NOS-Tg-r, y dos tipos de adyuvantes, hidróxido de aluminio y adyuvante de Freund. Se comprobó la presencia de anticuerpos policlonales con la técnica de ensayo inmunoenzimático indirecto. Los resultados obtenidos mostraron que a NOS-Tg-r con adyuvante de Freund indujo mayor respuesta inmune que la de la NOS-Tg-r con hidróxido aluminio p 0,005). Para verificar si había reacción cruzada, se realizó una prueba ELISA utilizando como antígenos: metaloproteasa de T. gondii recombinante, cisteína proteasa 5 de Entamoeba histolytica recombinante, albúmina al 2%, hidróxido de aluminio y adyuvante de Freund. Los valores obtenidos con sueros preinmunes y contra proteínas alternas no superaron el punto de corte (0,069), lo cual indica que los anticuerpos policlonales obtenidos son específicos para NOS-Tg-r. Se realizó marcación inmunológica en taquizoítos de Toxoplasma gondii con inmunofluorescencia indirecta que mostró una marcación difusa a nivel de citoplasma y confirmó la presencia de esta proteína en los taquizoítos.

The nitric oxide synthase (NOS)is an enzyme well described on mammals but little is known about the role of these enzymes on pathogenic parasites. We produced polyclonal antibodies against a recombinant NOS enzyme from Toxoplasma gondii nd e lso er formed n mmunol locali zation of the enzyme on tachyzoites. We used two New Zealand rabbits (Oryctolagus cuniculus) to perform intramuscular immunization and we used two types of adjuvant: aluminum hydroxide and Freund ’s adjuvant. We tested the generation of polyclonal antibodies by an indirect ELISA assay. The results showed that levels of antibodies were higher in rabbits immunized with Freund ’s adjuvant than with aluminum hydroxide (p =0.005). In order to test cross reactions, we used a recombinant Toxoplasma metallooprotease, a recombinant cysteine protease from Entamoeba histolytica, albumin 2%, hydroxide aluminium and Freund ’s adjuvant as antigens on indirect ELISA assays for the polyclonal serum antibodies. No serum showed absorbances higher than the cutoff level with these antigens, indicating that the polyclonal antibodies were specific for recombinant Toxoplasma NOS. Additionally, we performed immunodetection of the enzyme on Toxoplasma gondii tachyzoites and we obtained a diffuse labeling of the parasite.

Expression of the rice hoja blanca virus (RHBV) non-structural protein 3 (NS3) in Escherichia coli and its in situ localization in RHBV-infected rice tissues

The non-structural NS3 protein gene from the rice hoja blanca virus (RHBV) was fused to the glutathione-S-transferase carboxilic end and expressed in Escherichia coli strain JM83. Large quantities of fusion protein were produced in insoluble form. The fusion protein was fractionated in SDS-PAGE and purified by electroelution, polyclonal antibodies were raised in rabbit and the antiserum was absorbed with bacterial crude extract. A band of similar size as that of NS3 protein was observed in Western blots using extracts from RHBV-infected rice plants. Immunoelectron microscopy with colloidal gold-labeled antibodies against NS3 protein and the viral nucleocapsid protein revealed in situ accumulation of NS3 protein in the cytoplasm but not in the viral inclusion bodies, vacuoles or chloroplasts of RHBV-infected plants, following the same pattern of distribution as the RHBV nucleocapsid protein.